基因测序技术发展历史及一、二、三代测序技术原理和应用
基因测序技术发展历史及一、二、三代测序技术原理和应用
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基因测序技术
基因测序技术也称作DNA测序技术,即获得目的DNA片段碱基排列顺序的技术,获得目的DNA片段的序列是进一步进行分子生物学研究和基因改造的基础。
基因测序技术的发展历史
基因测序技术发展历史
1977年,Walter Gilbert和Frederick Sanger发明了第一台测序仪,并应用其测定了第一个基因组序列,噬菌体X174,全长5375个碱基。
由此开始,人类获得了探索生命遗传本质的能力,生命科学的研究进入了基因组学的时代,到至今为止的四十年时间内,测序技术已取得了相当大的发展,从第一代发展到了第三代测序技术。
Sanger所发明的测序方法被称为第一代测序技术,该技术直到现在依然被广泛使用,但是其一次只能获得一条长度在700~1000个碱基的序列,无法满足现代科学发展对生物基因序列获取的迫切需求。
高通量测序 (High-Throughput Sequencing, HTS) 是对传统Sanger测序的革命性变革,其解决了一代测序一次只能测定一条序列的限制,一次运行即可同时得到几十万到几百万条核酸分子的序列,因此也被称为新一代测序 (Next Generation Sequencing, NGS)或第二代测序。
第二代测序技术虽然测序的通量大大增加,但是其获得单条序列长度很短,想要得到准确的基因序列信息依赖于较高的测序覆盖度和准确的序列拼接技术,因此最终得到的结果中会存在一定的错误信息。
因此,科研人员又发明了第三代测序技术也称为单分子测序技术,该技术在保证测序通量的基础上,对单条长序列进行从头测序,能够直接得到长度在数万个碱基的核酸序列信息。
测序成本的变化
除了测序通量和读长的进步之外,测序技术的大范围应用最主要应该归功于成本的下降,在早期只有第一代测序技术之时,人类基因组计划耗资30亿美元才获得了大部分的人类基因组信息,这样高昂的成本显然不是常规科学研究者能够承受的。
基因测序技术成本变化
新一代测序技术的发明和应用大大降低了获取核酸序列所需的成本,其打破了摩尔定律的限制,使得获得基因序列所需的金钱出现了断崖式的下降,在2008年,全基因组测序的成本降至20万美元,到2010年,该费用已经可以控制在10000美元以内,目前,测定一个人类的全基因组只需要不到1000美元即可完成。
测序技术的发展方向
目前,基因测序技术已经在众多领域得到广泛应用,包括生物的基因组图谱绘制、环境基因组学和微生物多样性、转录水平动态响应及其调控机制,疾病相关基因的确定和诊断、表观遗传学和考古学、物种进化演替过程等等。
就当前市场形势看来第二代短读长测序技术在全球测序市场上仍然占有着绝对的优势地位,但第三代测序技术的应用也已在近几年实验了快速发展。
未来基因测序技术发展方向:
- 更快的序列获取速度;
- 更准确的碱基识别方式;
- 更长的单条测序序列长度;
- 更轻便的测序仪器平台;
- 更简便的操作过程;
- 更便宜的测序价格。
第一代测序技术
1975年由Frederick Sanger所提出的链终止法以及1977年由Walter Gibert所发明的链降解法被称为第一代测序技术。
1977年,Walter Gilbert和Frederick Sanger发明了第一台测序仪,并应用其测定了第一个基因组序列,噬菌体X174,全长5375个碱基。Walter Gilbert和Frederick Sanger也因在测序技术中的贡献获得了1980年诺贝尔化学奖。
技术原理
目前,基于第一代测序技术的测序仪几乎都是采用Sanger提出的链终止法。
链终止法测序的核心原理是ddNTP的2'和3'端都不含羟基,因此在合成核酸链的过程中无法形成磷酸二酯键,从而导致DNA合成反应中断。
在测定待测核酸片段的序列时,向反应体系中加入一定比例的带有放射性同位素标记的4种ddNTP,利用DNA聚合酶来延伸结合在待测核酸模板上的引物,直到掺入一种链终止核苷酸为止,最终会得到一组长度各相差一个碱基的链终止产物,这些产物可通过高分辨率变性凝胶电泳分离并根据其长度排序,凝胶处理后可用X-光胶片放射自显影进行检测,从而确定目的核酸片段各个位置的碱基。
完整的测序过程分为4步:
1. DNA碎片化:
如要利用Sanger测序方法进行完整基因组的测定,首先要将提取得到的样品完整DNA打碎,形成DNA片段,如只是测定单个目的基因的序列,则无需进行DNA碎片化。
DNA碎片化和体外克隆
2. PCR扩增和体外克隆:
针对特定目的核酸片段的测序,首先要对目的测序区域进行PCR扩增;而针对碎片化DNA的测序,则要将碎片化的DNA片段通过克隆的方式连接到质粒载体中;对于部分PCR产物的测序也可以对其进行克隆,以保证测序样品的纯度和浓度。
3. ddNTP法循环测序:
向得到的待测样品中分别加入4种dNTP和4种ddNTP,从而得到不同位置匹配终止的序列。
ddNTP循环测序
4. 凝胶电泳获得序列:
对得到的序列进行凝胶电泳,根据碱基的顺序和位置确定序列信息。
电泳确定序列
第一代测序技术的优势和劣势
优势:
- 第一代测序技术的准确性远高于二、三代测序,因此被称为测序行业的“金标准”;
- 第一代测序每个反应可以得到700-1000bp的序列,序列长度高于二代测序;
- 第一代测序价格低廉,设备运行时间短,适用于低通量的快速研究项目。
劣势:
- 第一代测序技术一个反应只能得到一条序列,因此测序通量很低;
- 第一代测序技术虽然单个反应价格低廉,但是获得大量序列的成本很高。
第一代测序技术的应用
- PCR产物测序:
对目的基因的PCR产物进行测序,得到目的基因序列; - 重测序:
突变、SNPs、插入或缺失克隆产物的验证; - 分型分析:
微生物和真菌分类学鉴定、HLA分型、病毒分型等; - 临床应用:
肿瘤突变基因的检测和肿瘤个体化治疗,致病基因位点明确并且数量有限的单基因遗传病检测; - 对新一代测序技术的结果进行验证。
第一代测序技术常见问题及解决方法
样品测序无信号
此时测序完全失败,最可能的原因是待测样品出现了降解或引物失效,从而导致测序引物与待测样品无法结合。
此时探索造成测序失败的具体原因并无实际意义,最快速、简便的办法是重新提供质量合格的引物和样品再次进行测序。
样品测序信号差
此种情况可能是引物或模板的质量不高或是引物和模板的匹配性不好引起的,但最有可能的原因是待测样品浓度偏低。
待测样品浓度偏低可能是由于PCR效率较低,也可能是PCR与测序间隔时间过长,导致PCR产物降解。建议PCR完成后尽快进行测序,如果PCR产物浓度本身较低,可以使用PCR产物作为模板进行二次PCR,也可以对PCR产物进行克隆后,再进行测序。
样品测序衰减
可能是由于待测样品包含特殊的核酸结构,如重复序列、回文结构、发卡结构、GC富集区、AT富集区等。
由于是样品本身结构问题,因此,无法通过优化测序反应解决,应从待测样品另一端进行反向测序,之后两端的测序结果拼接得到完整序列。
样品测序中断
此种情况是由于待测样品包含特殊高级结构,导致碱基无法与模板结合,DNA聚合酶无法继续延伸。
此情况与样品测序衰减解决办法相同,均为从待测样品另一端进行反向测序,经拼接后可以得到完整序列。
样品测序移码
测序从起始位置即发生移码是由于引物发生降解,应重新提供引物进行测序;
如测序过程中出现局部移码的现象,则可能是待测样品包含特殊高级结构,应当反向测序后拼接得到完整序列。
样品测序套峰
套峰细分的话有如下几种情形:
- 全双峰:
如样品为克隆后质粒,则质粒中含有多个引物结合位点;
如样品为PCR产物,则含有非特异性扩增。 - 前端双峰:
如样品为克隆后质粒,则其含有多个引物结合位点,并且其中一套模板出现测序中断的现象;
如样品为PCR产物,则PCR产物中含有多个引物结合位点,或者PCR产物中含有引物二聚体等小片段污染。 - 中间双峰:
如样品为克隆后质粒,则质粒并非单克隆;
如样品为PCR产物,则部分产物中具有碱基缺失现象,或目的基因为等位基因导致PCR产物自身不纯。 - 后端双峰:
如样品为克隆后质粒,则质粒并非单克隆;
如样品为PCR产物,则部分产物中具有碱基缺失现象。
解决办法:
- 针对二聚体及小片段干扰的情况,可以使用切胶回收的方法纯化PCR产物;
- 针对含有多个引物结合位点的情况,应当更换测序引物;
- 针对PCR产物出现碱基缺失的情况,可以使用克隆后测序以排除碱基缺失的产物;
- 针对非单克隆的情况,应在确认克隆无误的前提下重新挑取单克隆进行测序;
- 针对PCR产物含有非特异性扩增的情况,应优化PCR反应条件去除非特异性扩增,重新制备样品测序;
- 针对等位基因具有双模板的情况,应当采用克隆测序以保证单次测序样品序列一致。
样品测序底峰干扰
可能是由于测序引物不纯导致的,应当采用高纯度的引物 (PAGE级) 或重新提供引物进行测序。
第二代测序技术
高通量测序技术 (High-throughput sequencing, HTS) 是对传统Sanger测序技术革命性的变革,可以一次对几十万到几百万条核酸分子进行序列测定,因此也称其为下一代测序技术 (Next Generation Sequencing, NGS),高通量测序技术的出现使得对一个物种的转录组和基因组进行细致全貌的分析成为可能。
技术平台
经过科研人员的不断开发和改进,目前成熟的第二代测序技术共有3种,分别为Roche公司的454技术、ABI公司的SOLiD技术和Illumina公司的Solexa技术。
Roche/454
该技术由Jonathan Rothberg于2005年发明,该技术是第一个被发明的二代测序技术,该技术引领生命科学的研究进入高通量测序时代。该技术的基本原理是:一个片段 = 一个磁珠 = 一条读长,DNA片段无需进行荧光标记,无需电泳,边合成变测序,碱基在加入到序列中时,会脱掉一个焦磷酸,通过检测焦磷酸识别碱基,因此也被称为焦磷酸测序。
ABI/SOLiD
SOLiD技术是由连接酶测序法发展而来,Lerroy Hood在上世纪80年代中期利用连接酶法设计了第一台自动荧光测序仪。SOLiD以四色荧光标记寡核苷酸的连续连接合成为基础,取代了传统的聚合酶连接反应,可对单拷贝DNA片段进行大规模扩增和高通量并行测序。
Illumina/Solexa
Illumina公司的第二代测序仪最早由Solexa公司研发,其同样为边合成边测序,该技术在测序的过程中,加入改造过的DNA聚合酶和带有4种荧光标记的dNTP,因为dNTP的3'羟基末端带有可化学切割的部分,它只容许每个循环掺入单个碱基,此时,用激光扫描反应板表面,根据dNTP所带的荧光读取每条模板序列每一轮反应所聚合上去的核苷酸种类,经过“合成-清洗-拍照”的循环过程,最终得到目的片段的碱基排列顺序。
技术原理
Roche/454
Roche/454技术原理
1. Preparation
454测序技术利用喷雾法将待测DNA打断成300-800bp长的小片段,并在片段两端加上不同的接头,或将待测DNA变性后用杂交引物进行PCR扩增,连接载体,构建单链DNA文库。
2. Emulsion PCR
在PCR反应前,将包含PCR所有反应成分的水溶液注入高速旋转的矿物油表面,形成被矿物油包裹的无数个小水滴,每一个小水滴即为一个独立的PCR反应空间,理想状态下,每一个小水滴只包含一个DNA模板和一个磁珠,磁珠表面含有与接头互补的DNA序列,经过PCR扩增后,磁珠上会富集大量序列相同的PCR产物,从而达到测序所需DNA量的要求。
3. Sequencing
测序时,需将磁珠固定在特制的PTP平板上。这种平板上含有许多直径约为44μm的小孔,每个小孔仅能容纳一个磁珠,通过这种方法来固定每个磁珠的位置。
启动测序反应后,每次向PTP平板中加入一种dNTP,如果能与待测序列配对,则会在碱基连接在模板上之后释放焦磷酸,焦磷酸通过ATP硫酸化学酶激活荧光素酶产生荧光,通过PTP板另一侧的CCD照相机记录荧光,从而确定目的模板的核酸序列。
ABI/SOLiD
ABI/SOLiD技术原理
SOLiD测序技术与454技术的原理比较类似,同样是采用油包水的方式进行Emulsion PCR。
不同之处在于SOLiD形成的小水滴要比454系统小得多,只有1μm大小,并且在PCR扩增的同时对扩增产物的3'端进行修饰,为下一步的测序做准备。
在PCR完成之后,SOLiD技术进行测序时,其反应底物不是dNTP也不是ddNTP,而含有8个碱基的单链荧光探针混合物,在测序时,这些探针按照碱基互补规则与单链DNA模板链配对,不同的探针的5'末端分别标记不同颜色的荧光染料,每两个碱基确定一个荧光信号,相当于一次能决定两个碱基,因此,这种测序方法也被称为两碱基测序法。
Illumina/Solexa
Illumina/Solexa技术原理
1. Preparation
通过不同的方法将打碎的DNA碎片末端连接序列已知的接头,构建单链DNA测序文库。
2. Immobilization and Bridge PCR
将测序文库的每一条单链DNA通过特异性的接头固定在一个固体支撑体上,固体支撑体的每一个单独小空间中只包含一条DNA链,之后通过PCR特异性的将模板DNA进行富集,从而达到测序所需的模板量。
3. Sequencing
对每一个单独的链进行碱基互补配对,反应试剂清洗和成像捕捉,不断反复进行此三步循环,每一个循环按顺序测定序列中的一个碱基。
第二代测序技术的优缺点
第二代测序技术的优点:
- 一次能够同时得到大量的序列数据,相比于一代测序技术,通量提高了成千上万倍;
- 单条序列成本非常低廉。
第二代测序技术的缺点:
- 序列读长较短,Illumina平台最长为250-300bp,454平台也只有500bp左右;
- 由于建库中利用了PCR富集序列,因此有一些含量较少的序列可能无法被大量扩增,造成一些信息的丢失,且PCR过程中有一定概率会引入错配碱基;
- 想要得到准确和长度较长的拼接结果,需要测序的覆盖率较高,导致结果错误较多和成本增加。
第二代测序技术的应用
二代测序是现阶段科研市场的主力平台,主要应用包括:基因组测序、转录组测序、群体测序、扩增子测序、宏基因组测序、重测序等。
由于成本较低,二代测序在医学领域应用也十分广泛,主要包括:癌症基因组、遗传病基因组、肿瘤与代谢疾病等。
不同测序平台的参数比较
第三代测序技术
以PacBio公司的SMRT技术和Oxford Nanopore Technologies公司的纳米孔单分子技术为代表的新一代测序技术被称为第三代测序技术,与前两代测序技术相比,其最大的特点就是单分子测序,测序过程无需进行PCR扩增,并且理论上可以测定无限长度的核酸序列。
PacBio技术平台
SMRT芯片是一种带有很多ZMW孔的厚度为100nm的金属片,将DNA聚合酶、待测序列和不同荧光标记的dNTP放入ZMW孔的底部。荧光标记的位置是磷酸基团,当一个dNTP被添加到合成链上的同时,它会进入ZMW孔的荧光信号检测区,根据荧光的种类就可以判定dNTP的种类,从而获得核酸的碱基序列信息。
ZMW孔
PacBio平台测序原理
每个ZWM孔只允许一条DNA模板进入,DNA模板进入后,DNA聚合酶与模板结合,加入4种不同颜色荧光标记4种dNTP,其通过布朗运动随机进入检测区域并与聚合酶结合从而延伸模板,与模板匹配的碱基生成化学键的时间远远长于其他碱基停留的时间,因此统计荧光信号存在时间的长短,可区分匹配的碱基与游离碱基。通过统计4种荧光信号与时间的关系,即可测定DNA模板序列。
PacBio测序原理(来自PacBio官网)
PacBio平台技术关键
- DNA聚合酶,该技术得到的序列读长主要跟DNA聚合酶的活性有关,它主要受激光对其造成的损伤所影响。
- 荧光基团标记在核苷酸3'端磷酸上,在DNA合成过程中,3'端的磷酸键随着DNA链的延伸被断开,标记物被弃去,减少了DNA合成的空间位阻,维持DNA链连续合成,延长了测序读长。
- ZMW (零模波导孔),将反应信号与周围游离碱基的强大荧光背景进行区分,在一个反应管中有许多这样的圆形纳米小孔,其外径仅有100nm,激光从底部打出后不能穿透小孔进入上方溶液区,能量被限制在一个小范围里,使得荧光信号仅来自这个小反应区域,孔外其它游离核苷酸单体依然留在黑暗中,从而实现将背景荧光降到最低。
PacBio平台技术优势
1. 近乎完美的一致性和准确性
三代测序单碱基错误率虽然很高,但是这种单碱基的错误是随机发生的,因此,对同一段序列测序覆盖多次就能够进行纠错,一般覆盖到10X以上的深度就能达到99.9%的正确率。
2. 不存在测序的偏好性
因为SMRT技术在样本制备时无需PCR扩增,对于某些具有极端的碱基组成的核酸区域,三代测序也是无偏好性的,同时也不受回文序列的影响。
3. 序列准确比对
二代测序得到的序列由于长度不够,在进行比对时,会出现很多错误匹配,从而造成假阳性SNP位点;而PacBio测序平台得到的序列能够较均匀的覆盖参考基因组,每个序列能够明确的比对到相应的区域,在避免假阳性的同时,得到更加准确的变异位点和类型。
PacBio技术的优缺点
PacBio技术的优点:
- 无需PCR扩增,不会人为的引入突变;
- 超长读长,平均读长可达到10Kb,最长读长可以达到40Kb;
- 覆盖均匀,无GC偏好性;
- 通过reads的自我矫正,10X以上准确率能够达到99.9%;
- 可以直接检测到甲基化信息,同步进行表观遗传学识别。
PacBio技术的缺点:
- 单条序列错误率较高,平均核苷酸准确性不到85%;
- 测序成本较贵。
PacBio技术的应用
基因组组装
利用PacBio测序平台,可以克服部分序列GC含量高或重复序列多等问题,更好的进行基因组详细描绘,从而进行精细的基因注释等研究。
PacBio测序平台不需要进行PCR扩增,因此可以减少基因组组装过程中的人为错误和偏差。
PacBio测序平台读长较长,因此相比二代测序拼接结果更为准确,同时可以利用其长片段来填补二代数据组装中产生的gap和连接contig为scaffold。
全长转录组测序
利用PacBio测序平台读长较长的特点,进行转录组测序可以直接得到转录本的全长序列,省去了二代测序的拼接过程,使得过程更为简便,结果更为准确。
甲基化分析
PacBio测序的技术原理可以直接检测到发生甲基化的核苷酸,因此可以在进行其它测序分析的同时完成DNA甲基化的分析。
Nanopore技术测序原理
将在某一面上含有一对电极的特殊脂质双分子层置于一个微孔之上,该双分子层中含有很多由α溶血素蛋白组成的纳米孔,并且每个纳米孔会结合一个核酸外切酶。
当DNA模板进入孔道时,孔道中的核酸外切酶会“抓住”DNA分子,顺序剪切掉穿过纳米孔道的DNA碱基,每一个碱基通过纳米孔时都会产生一个阻断,根据阻断电流的变化就能检测出相应碱基的种类,最终得出DNA分子的序列。
Nanopore技术原理
Nanopore技术的优缺点
Nanopore技术的优点:
- 可以检测结构变异和可变剪切;
- 能直接对RNA分子进行测序;
- 能对修饰过的碱基进行测序;
- 测序读长更长,可以达到150kb;
- 测序数据可以做到实时监控;
- 运行速度快。
Nanopore技术的缺点:
采用的是水解测序法,不能进行重复测序,因而无法达到一个满意的测序精确度。
Nanopore技术的应用
基因组组装
利用其测序长的特点,可以填补基因组中大片段的gap。
临床应用
对于临床实践,实时获取和分析DNA/RNA序列是一件很重要的事情,对于传统的高通量测序,做到这一点非常困难,但对于Nanopore技术平台,实现实时获取序列相对容易。
Nanopore技术平台体积小、易操作,其通过电流变化检测并识别碱基,这种设计允许用户在测序过程中根据实时结果做出一些判断,对于即时诊疗有重要意义。
基于Nanopore技术的测序平台获得序列时间相比于其它平台要短得多,因此更加适合于临床环境,使得医生能够快速获得检测结果。利用Nanopore技术平台从临床样品准备到发现致病菌只需要6小时,而完成胎儿非整倍体检查只需4小时,这些应用如果利用二代测序平台可能需要数天甚至数周时间。
甲基化分析
Nanopore测序技术可以检测四种胞嘧啶碱基修饰,分别为5-methycytosine、5-hydroxymethycytosine、5-formylcytosine和5-carboxylcytosine,检测准确率为92%-98%。
不同三代测序平台的比较
图片来源:
Shendure J, Ji, Hanlee. Next-generation DNA sequencing[J]. NATURE BIOTECHNOLOGY, 2008, 26(10):1135-1145.
Zhang Z, Shen J, Wang H, et al. Effects of Graphene Nanopore Geometry on DNA Sequencing[J]. Journal of Physical Chemistry Letters, 2014, 5(9):1602–1607.
写在后面:该篇文章并非完全原创,是多年前整理网络上相关文章而得,当时只是留作自学用途,但是由于时间较长,具体参考了那些文章已经忘记了,在此对这些文章的作者深表感谢!
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软硬件平台 软件是博图 TIA v15,硬件是西门子300系列 PLC 简介 使用scl语言编写一个FC子程序,对模拟量进行处理,对模拟数据进行转换。 详细介绍 添加新块,添加一个FC块,语言选择scl 添加变量,输入型变…...
2024/5/7 23:52:28
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某天得到一个需求,一个工程,本来是没有做权限校验的,直接访问,后来需要做权限校验了,就加了一个全局拦截器,拦截token进行校验,但这个服务有几个定时任务在访问本服务的接口,这些定时…...
2024/5/8 7:21:48 - 梯度消失和梯度爆炸的一些处理方法
在这里是记录一下梯度消失或梯度爆炸的一些处理技巧。全当学习总结了如有错误还请留言,在此感激不尽。 权重和梯度的更新公式如下: w w − η ⋅ ∇ w w w - \eta \cdot \nabla w ww−η⋅∇w 个人通俗的理解梯度消失就是网络模型在反向求导的时候出…...
2024/5/7 10:36:02 - Linux mount用法
在Linux系统中,系统自动挂载了以下挂载点: /: xfs文件系统,根文件系统, 所有其他文件系统的挂载点。 /sys: sysfs文件系统,提供内核对象的信息和接口。 /proc: proc文件系统,提供进程和系统信息。 /dev: devtmpfs文件系…...
2024/5/5 8:38:45 - Redis分区
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2024/5/5 1:23:35 - 416. 分割等和子集问题(动态规划)
题目 题解 class Solution:def canPartition(self, nums: List[int]) -> bool:# badcaseif not nums:return True# 不能被2整除if sum(nums) % 2 ! 0:return False# 状态定义:dp[i][j]表示当背包容量为j,用前i个物品是否正好可以将背包填满ÿ…...
2024/5/7 19:05:20 - 【Java】ExcelWriter自适应宽度工具类(支持中文)
工具类 import org.apache.poi.ss.usermodel.Cell; import org.apache.poi.ss.usermodel.CellType; import org.apache.poi.ss.usermodel.Row; import org.apache.poi.ss.usermodel.Sheet;/*** Excel工具类** author xiaoming* date 2023/11/17 10:40*/ public class ExcelUti…...
2024/5/7 22:31:36 - Spring cloud负载均衡@LoadBalanced LoadBalancerClient
LoadBalance vs Ribbon 由于Spring cloud2020之后移除了Ribbon,直接使用Spring Cloud LoadBalancer作为客户端负载均衡组件,我们讨论Spring负载均衡以Spring Cloud2020之后版本为主,学习Spring Cloud LoadBalance,暂不讨论Ribbon…...
2024/5/8 1:37:40 - TSINGSEE青犀AI智能分析+视频监控工业园区周界安全防范方案
一、背景需求分析 在工业产业园、化工园或生产制造园区中,周界防范意义重大,对园区的安全起到重要的作用。常规的安防方式是采用人员巡查,人力投入成本大而且效率低。周界一旦被破坏或入侵,会影响园区人员和资产安全,…...
2024/5/7 14:19:30 - VB.net WebBrowser网页元素抓取分析方法
在用WebBrowser编程实现网页操作自动化时,常要分析网页Html,例如网页在加载数据时,常会显示“系统处理中,请稍候..”,我们需要在数据加载完成后才能继续下一步操作,如何抓取这个信息的网页html元素变化&…...
2024/5/8 1:37:39 - 【Objective-C】Objective-C汇总
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2024/5/7 16:57:02 - 【洛谷算法题】P5713-洛谷团队系统【入门2分支结构】
👨💻博客主页:花无缺 欢迎 点赞👍 收藏⭐ 留言📝 加关注✅! 本文由 花无缺 原创 收录于专栏 【洛谷算法题】 文章目录 【洛谷算法题】P5713-洛谷团队系统【入门2分支结构】🌏题目描述🌏输入格…...
2024/5/7 14:58:59 - 【ES6.0】- 扩展运算符(...)
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2024/5/7 1:54:46 - 摩根看好的前智能硬件头部品牌双11交易数据极度异常!——是模式创新还是饮鸩止渴?
文 | 螳螂观察 作者 | 李燃 双11狂欢已落下帷幕,各大品牌纷纷晒出优异的成绩单,摩根士丹利投资的智能硬件头部品牌凯迪仕也不例外。然而有爆料称,在自媒体平台发布霸榜各大榜单喜讯的凯迪仕智能锁,多个平台数据都表现出极度异常…...
2024/5/7 21:15:55 - Go语言常用命令详解(二)
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2024/5/8 1:37:35 - 用欧拉路径判断图同构推出reverse合法性:1116T4
http://cplusoj.com/d/senior/p/SS231116D 假设我们要把 a a a 变成 b b b,我们在 a i a_i ai 和 a i 1 a_{i1} ai1 之间连边, b b b 同理,则 a a a 能变成 b b b 的充要条件是两图 A , B A,B A,B 同构。 必要性显然࿰…...
2024/5/7 16:05:05 - 【NGINX--1】基础知识
1、在 Debian/Ubuntu 上安装 NGINX 在 Debian 或 Ubuntu 机器上安装 NGINX 开源版。 更新已配置源的软件包信息,并安装一些有助于配置官方 NGINX 软件包仓库的软件包: apt-get update apt install -y curl gnupg2 ca-certificates lsb-release debian-…...
2024/5/7 16:04:58 - Hive默认分割符、存储格式与数据压缩
目录 1、Hive默认分割符2、Hive存储格式3、Hive数据压缩 1、Hive默认分割符 Hive创建表时指定的行受限(ROW FORMAT)配置标准HQL为: ... ROW FORMAT DELIMITED FIELDS TERMINATED BY \u0001 COLLECTION ITEMS TERMINATED BY , MAP KEYS TERMI…...
2024/5/8 1:37:32 - 【论文阅读】MAG:一种用于航天器遥测数据中有效异常检测的新方法
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2024/5/7 16:05:05 - --max-old-space-size=8192报错
vue项目运行时,如果经常运行慢,崩溃停止服务,报如下错误 FATAL ERROR: CALL_AND_RETRY_LAST Allocation failed - JavaScript heap out of memory 因为在 Node 中,通过JavaScript使用内存时只能使用部分内存(64位系统&…...
2024/5/8 1:37:31 - 基于深度学习的恶意软件检测
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C中只能有一个实例的单例类 前面讨论的 President 类很不错,但存在一个缺陷:无法禁止通过实例化多个对象来创建多名总统: President One, Two, Three; 由于复制构造函数是私有的,其中每个对象都是不可复制的,但您的目…...
2024/5/7 7:26:29 - python django 小程序图书借阅源码
开发工具: PyCharm,mysql5.7,微信开发者工具 技术说明: python django html 小程序 功能介绍: 用户端: 登录注册(含授权登录) 首页显示搜索图书,轮播图࿰…...
2024/5/8 1:37:29 - 电子学会C/C++编程等级考试2022年03月(一级)真题解析
C/C++等级考试(1~8级)全部真题・点这里 第1题:双精度浮点数的输入输出 输入一个双精度浮点数,保留8位小数,输出这个浮点数。 时间限制:1000 内存限制:65536输入 只有一行,一个双精度浮点数。输出 一行,保留8位小数的浮点数。样例输入 3.1415926535798932样例输出 3.1…...
2024/5/7 17:09:45 - 配置失败还原请勿关闭计算机,电脑开机屏幕上面显示,配置失败还原更改 请勿关闭计算机 开不了机 这个问题怎么办...
解析如下:1、长按电脑电源键直至关机,然后再按一次电源健重启电脑,按F8健进入安全模式2、安全模式下进入Windows系统桌面后,按住“winR”打开运行窗口,输入“services.msc”打开服务设置3、在服务界面,选中…...
2022/11/19 21:17:18 - 错误使用 reshape要执行 RESHAPE,请勿更改元素数目。
%读入6幅图像(每一幅图像的大小是564*564) f1 imread(WashingtonDC_Band1_564.tif); subplot(3,2,1),imshow(f1); f2 imread(WashingtonDC_Band2_564.tif); subplot(3,2,2),imshow(f2); f3 imread(WashingtonDC_Band3_564.tif); subplot(3,2,3),imsho…...
2022/11/19 21:17:16 - 配置 已完成 请勿关闭计算机,win7系统关机提示“配置Windows Update已完成30%请勿关闭计算机...
win7系统关机提示“配置Windows Update已完成30%请勿关闭计算机”问题的解决方法在win7系统关机时如果有升级系统的或者其他需要会直接进入一个 等待界面,在等待界面中我们需要等待操作结束才能关机,虽然这比较麻烦,但是对系统进行配置和升级…...
2022/11/19 21:17:15 - 台式电脑显示配置100%请勿关闭计算机,“准备配置windows 请勿关闭计算机”的解决方法...
有不少用户在重装Win7系统或更新系统后会遇到“准备配置windows,请勿关闭计算机”的提示,要过很久才能进入系统,有的用户甚至几个小时也无法进入,下面就教大家这个问题的解决方法。第一种方法:我们首先在左下角的“开始…...
2022/11/19 21:17:14 - win7 正在配置 请勿关闭计算机,怎么办Win7开机显示正在配置Windows Update请勿关机...
置信有很多用户都跟小编一样遇到过这样的问题,电脑时发现开机屏幕显现“正在配置Windows Update,请勿关机”(如下图所示),而且还需求等大约5分钟才干进入系统。这是怎样回事呢?一切都是正常操作的,为什么开时机呈现“正…...
2022/11/19 21:17:13 - 准备配置windows 请勿关闭计算机 蓝屏,Win7开机总是出现提示“配置Windows请勿关机”...
Win7系统开机启动时总是出现“配置Windows请勿关机”的提示,没过几秒后电脑自动重启,每次开机都这样无法进入系统,此时碰到这种现象的用户就可以使用以下5种方法解决问题。方法一:开机按下F8,在出现的Windows高级启动选…...
2022/11/19 21:17:12 - 准备windows请勿关闭计算机要多久,windows10系统提示正在准备windows请勿关闭计算机怎么办...
有不少windows10系统用户反映说碰到这样一个情况,就是电脑提示正在准备windows请勿关闭计算机,碰到这样的问题该怎么解决呢,现在小编就给大家分享一下windows10系统提示正在准备windows请勿关闭计算机的具体第一种方法:1、2、依次…...
2022/11/19 21:17:11 - 配置 已完成 请勿关闭计算机,win7系统关机提示“配置Windows Update已完成30%请勿关闭计算机”的解决方法...
今天和大家分享一下win7系统重装了Win7旗舰版系统后,每次关机的时候桌面上都会显示一个“配置Windows Update的界面,提示请勿关闭计算机”,每次停留好几分钟才能正常关机,导致什么情况引起的呢?出现配置Windows Update…...
2022/11/19 21:17:10 - 电脑桌面一直是清理请关闭计算机,windows7一直卡在清理 请勿关闭计算机-win7清理请勿关机,win7配置更新35%不动...
只能是等着,别无他法。说是卡着如果你看硬盘灯应该在读写。如果从 Win 10 无法正常回滚,只能是考虑备份数据后重装系统了。解决来方案一:管理员运行cmd:net stop WuAuServcd %windir%ren SoftwareDistribution SDoldnet start WuA…...
2022/11/19 21:17:09 - 计算机配置更新不起,电脑提示“配置Windows Update请勿关闭计算机”怎么办?
原标题:电脑提示“配置Windows Update请勿关闭计算机”怎么办?win7系统中在开机与关闭的时候总是显示“配置windows update请勿关闭计算机”相信有不少朋友都曾遇到过一次两次还能忍但经常遇到就叫人感到心烦了遇到这种问题怎么办呢?一般的方…...
2022/11/19 21:17:08 - 计算机正在配置无法关机,关机提示 windows7 正在配置windows 请勿关闭计算机 ,然后等了一晚上也没有关掉。现在电脑无法正常关机...
关机提示 windows7 正在配置windows 请勿关闭计算机 ,然后等了一晚上也没有关掉。现在电脑无法正常关机以下文字资料是由(历史新知网www.lishixinzhi.com)小编为大家搜集整理后发布的内容,让我们赶快一起来看一下吧!关机提示 windows7 正在配…...
2022/11/19 21:17:05 - 钉钉提示请勿通过开发者调试模式_钉钉请勿通过开发者调试模式是真的吗好不好用...
钉钉请勿通过开发者调试模式是真的吗好不好用 更新时间:2020-04-20 22:24:19 浏览次数:729次 区域: 南阳 > 卧龙 列举网提醒您:为保障您的权益,请不要提前支付任何费用! 虚拟位置外设器!!轨迹模拟&虚拟位置外设神器 专业用于:钉钉,外勤365,红圈通,企业微信和…...
2022/11/19 21:17:05 - 配置失败还原请勿关闭计算机怎么办,win7系统出现“配置windows update失败 还原更改 请勿关闭计算机”,长时间没反应,无法进入系统的解决方案...
前几天班里有位学生电脑(windows 7系统)出问题了,具体表现是开机时一直停留在“配置windows update失败 还原更改 请勿关闭计算机”这个界面,长时间没反应,无法进入系统。这个问题原来帮其他同学也解决过,网上搜了不少资料&#x…...
2022/11/19 21:17:04 - 一个电脑无法关闭计算机你应该怎么办,电脑显示“清理请勿关闭计算机”怎么办?...
本文为你提供了3个有效解决电脑显示“清理请勿关闭计算机”问题的方法,并在最后教给你1种保护系统安全的好方法,一起来看看!电脑出现“清理请勿关闭计算机”在Windows 7(SP1)和Windows Server 2008 R2 SP1中,添加了1个新功能在“磁…...
2022/11/19 21:17:03 - 请勿关闭计算机还原更改要多久,电脑显示:配置windows更新失败,正在还原更改,请勿关闭计算机怎么办...
许多用户在长期不使用电脑的时候,开启电脑发现电脑显示:配置windows更新失败,正在还原更改,请勿关闭计算机。。.这要怎么办呢?下面小编就带着大家一起看看吧!如果能够正常进入系统,建议您暂时移…...
2022/11/19 21:17:02 - 还原更改请勿关闭计算机 要多久,配置windows update失败 还原更改 请勿关闭计算机,电脑开机后一直显示以...
配置windows update失败 还原更改 请勿关闭计算机,电脑开机后一直显示以以下文字资料是由(历史新知网www.lishixinzhi.com)小编为大家搜集整理后发布的内容,让我们赶快一起来看一下吧!配置windows update失败 还原更改 请勿关闭计算机&#x…...
2022/11/19 21:17:01 - 电脑配置中请勿关闭计算机怎么办,准备配置windows请勿关闭计算机一直显示怎么办【图解】...
不知道大家有没有遇到过这样的一个问题,就是我们的win7系统在关机的时候,总是喜欢显示“准备配置windows,请勿关机”这样的一个页面,没有什么大碍,但是如果一直等着的话就要两个小时甚至更久都关不了机,非常…...
2022/11/19 21:17:00 - 正在准备配置请勿关闭计算机,正在准备配置windows请勿关闭计算机时间长了解决教程...
当电脑出现正在准备配置windows请勿关闭计算机时,一般是您正对windows进行升级,但是这个要是长时间没有反应,我们不能再傻等下去了。可能是电脑出了别的问题了,来看看教程的说法。正在准备配置windows请勿关闭计算机时间长了方法一…...
2022/11/19 21:16:59 - 配置失败还原请勿关闭计算机,配置Windows Update失败,还原更改请勿关闭计算机...
我们使用电脑的过程中有时会遇到这种情况,当我们打开电脑之后,发现一直停留在一个界面:“配置Windows Update失败,还原更改请勿关闭计算机”,等了许久还是无法进入系统。如果我们遇到此类问题应该如何解决呢࿰…...
2022/11/19 21:16:58 - 如何在iPhone上关闭“请勿打扰”
Apple’s “Do Not Disturb While Driving” is a potentially lifesaving iPhone feature, but it doesn’t always turn on automatically at the appropriate time. For example, you might be a passenger in a moving car, but your iPhone may think you’re the one dri…...
2022/11/19 21:16:57