在二代测序领域，illumina测序平台以其核心的三项技术（分别是碱基末端可逆修饰、桥式PCR和边合成变测序策略），独步天下。充分发挥了其碱基读取精确、通量提高、测序长度也稳步提高至双末端各300bp。但是，任何测序技术面对各种测序需求总是会有些许不足，大白话说就是：没有哪项技术可以解决全部的问题。那么，illumina测序有哪些问题是需要注意的呢？我们就来聊聊这个话题。
问题一、测序过程中必须碱基平衡
所谓碱基平衡，是指，测序芯片上完成成簇反应之后，一定面积内的不同分子簇，各个位置的碱基A、T、G、C分布均匀。这样才可以较好的完成信号转换。如若不然，那么对于碱基的判读就会出现错误，从而导致测序质量值大幅度下降。
反应在测序文库上，就是一次测序反应中，应该尽量多添加诸如基因组DNA文库，RNA转录组文库，而少掺入一些扩增子文库。这里的扩增子文库是指类似16s/18s/ITS可变区文库。如果实在凑不齐文库，那么就应该认为掺入大量的平衡碱基文库。包括phix文库、基因组文库等。同时，也可以尽量多掺入不同类型的扩增子文库。或者，对扩增子文库的barcode序列做一些错位（spacer）设计，增加碱基的平衡性。

上图即是平衡文库和非平衡文库测序数据差别，其中碱基不平衡文库曲线非常糟糕，数据质量会很差。
问题二、读取长度受限
尽管目前illumina的测序读长已经达到双末端300bp，但是想要进一步提高测序读长，还是非常困难的。主要的原因在于，第一，扩增测序的酶活性需要进一步提高太难。目前Illumina MiSeq测序，完成一次测序，需要耗时超过60小时，加上文库混合时间，还会超出这个时间。60小时内能维持酶的活性已经非常不错了，再要提高就比较难。第二，基于单次只测一个碱基的边合成边测序原理，要求对各个分子簇的反应时间要求一致。也就是各个分子簇必须同时进行反应。理想状态当然是如此，但是实际PCR反应过程中，各个分子的反应时间还是不尽相同的。因此，会产生有的分子簇内的分子反应的快，有的慢的情况（这种现象被称作phasing，一般和酶活有关）。导致的结果就是，一个分子簇内的信号颜色不一样。那么越到测序后期，其碱基判读就越不准确。因此想要提升读长，illumina的增长潜力非常有限。解决问题的最终办法还是要靠长度长的三代测序技术。

图片来自网络。
上图较好的反映了phasing现象
问题三、文库长度受限
文库长度的意思是指，含两侧测序接头和插入目标片段，整个文库的长度范围不能过宽，一般建议在250bp-450bp之间比较好，超过600bp以上就会造成一些不利影响。主要是短片段和长片段一起测序的时候，短片段的扩增效率一般都高于长片段的，因此更容易测到序列，长一些的文库就不容易测到序列，导致数据产出有偏差。另一个原因是，如果文库片段过短的话，该短片段测序到后期，就是要测接头序列了，有的时候连接头序列都测完了，那就没有信号了，后续会读取一些假信号，降低测序质量值。

了解了上述问题之后，可以对我们日常测序进行指导，规避一些不必要的麻烦，提高测序文库质量，同时提高测序质量及效率。

参考资料：
https://support.illumina.com/bulletins/2016/07/what-is-nucleotide-diversity-and-why-is-it-important-.html